4 - Tests de vieillissement
Les tests de vieillissement [11][1] permettent d'évaluer la croissance des micro-organismes dans les aliments naturellement contaminés, conservés dans des conditions raisonnablement prévisibles. La température et la durée de conservation sont des paramètres essentiels agissant sur le développement microbien. Les tests de vieillissement incluent donc une rupture de la chaîne du froid, sauf si le professionnel peut justifier d'une chaîne du froid totalement maîtrisée.
Ces tests, faciles à mettre en œuvre, sont incontournables et fournissent des informations essentielles et suffisantes pour valider et vérifier la durée de vie microbiologique au regard des flores normalement présentes dans un aliment (flores indicatrices d'hygiène et micro-organismes d'altération).
En revanche, dans le cadre des tests de vieillissement, la recherche des micro-organismes pathogènes (critères de sécurité ou autres) soumis à un critère qualitatif (absence dans x grammes) n'est pas pertinente pour la validation et la vérification d'une DVM. La recherche de ces micro-organismes pathogènes doit, en revanche, être réalisée dans le cadre des auto-contrôles à J0 dans l'objectif d'évaluer le niveau de maîtrise du procédé de fabrication et de pouvoir mettre en œuvre sans délai des mesures de gestion en cas de résultat non-conforme.
Les lignes directrices pour la mise en œuvre des tests de vieillissement sont décrites dans la norme NF V01-003 [12][2] et, pour Listeria monocytogenes dans les denrées prêtes à consommer, dans le guide technique du Laboratoire de référence de l'Union européenne [13][3] pour Listeria monocytogenes (cf. chapitre 4 de ce guide).
a) Validation initiale de la DVM⚓
Pour la validation initiale d'une DVM, les tests de vieillissement doivent porter sur tous les microorganismes identifiés dans l'analyse des dangers pour lesquels il existe un critère quantitatif en fin de DVM (cf V-B-2 : critères réglementaires, critères définis dans les GBPH validés, critères des interprofessions...).
Le cas particulier de Listeria monocytogenes est traité à part (cf. paragraphe V-B-4- c).
Les tests de vieillissement sont réalisés par un laboratoire satisfaisant aux exigences générales concernant la compétence des laboratoires (de préférence par des laboratoires accrédités ou, a minima sous assurance qualité et reliés à un réseau d'analyses d'inter-comparaison) et mettant en œuvre les méthodes d'analyse de référence précisées en annexe I du Reg CE 2073/2005 ou les méthodes alternatives commerciales validées par rapport à la méthode de référence et certifiées par une tierce partie conformément au protocole défini dans la norme NF EN ISO 16140 (2003) ou la norme NF EN ISO 16140-2 (2016).
Ces analyses sont réalisées sur au moins un produit représentatif de chaque catégorie de produits finis correspondant à un procédé de fabrication identifié et homogène sur le plan de la maîtrise des dangers microbiologiques et selon un plan d'échantillonnage représentatif des conditions de production avec, au minimum, n=5, en application du Reg CE 2073/2005.
Il peut s'agir de cinq unités :
- issues du même lot : afin de tenir compte de la variabilité inter-lots, il est recommandé de renouveler ces analyses, de préférence pour trois lots de fabrication ;
- ou, pour les petites structures, issues de cinq lots différents (à raison d'une unité par lot) d'un même produit représentatif de la catégorie de produits finis homogènes, afin de prendre en compte la variabilité inter-lots.
La manière dont ces échantillons sont sélectionnés aura un impact sur la fiabilité du résultat. Si plusieurs prélèvements sont réalisés au cours de la fabrication d'un lot, il devront être représentatifs des différentes étapes de cette séquence :
- le début de la production peut être marqué par une montée en température insuffisante des équipements, par une contamination liée à l'introduction des ingrédients, ...
- la fin de la production peut être associée à une succession d'ouvertures/fermetures d'un équipement, avec autant de risques de contamination,
- plus généralement, les différents échantillons doivent permettre d'illustrer la diversité susceptible d'exister dans la qualité du lot fabriqué ; si cette diversité est très importante, il convient de revenir en arrière et de s'interroger sur la segmentation de la production en lots.
Si un seul échantillon est sélectionné, celui-ci doit illustrer les conditions de fabrication les plus défavorables, c'est-à-dire les plus risquées au regard d'une possible contamination du produit. Le choix de cet échantillon doit donc être fait en lien étroit avec l'analyse des dangers.
b) Vérification de la DVM⚓
Les tests de vieillissement réalisés dans le cadre de la validation initiale de la DVM portent sur un faible nombre d'échantillons : il convient de garder en mémoire que, pour un plan d'échantillonnage quel qu'il soit, il y a un risque d'accepter un lot non satisfaisant. Le tableau en annexe I présente ainsi les pourcentages estimés d'unités dépassant une limite fixée en fin de durée de vie en fonction du nombre d'unités testées.
Sous réserve que toutes les unités du lot puissent être prélevées avec la même probabilité, plus le nombre d'unités testées est important, plus le niveau de confiance dans la maîtrise du processus s'accroît.
Mais, comme évoqué plus haut, il faut veiller à ce que les échantillons prélevés illustrent toute la diversité potentielle du lot, donc toutes les séquences de sa production. Des biais peuvent apparaître au moment de prélever les échantillons : le fait de prélever les échantillons sur le dessus d'un carton ou d'une palette ne permet pas de rendre le prélèvement de toutes les unités du lot équiprobable ; mieux vaut prélever les échantillons sur un tapis de convoyage individuel.
Ainsi, afin d'accroître le nombre d'unités testées, des tests de vieillissement doivent être réalisés périodiquement dans le cadre de la vérification de la DVM selon une fréquence appropriée, tenant compte notamment des volumes de production ou d'autres critères techniques.
Ces tests contribuent à augmenter le niveau de confiance concernant la fiabilité de la DVM dans les conditions raisonnablement prévisibles d'utilisation de la denrée.
Ces analyses peuvent être réalisées selon un plan d'échantillonnage avec n=1. Elles doivent inclure les différents produits de chaque catégorie de produits finis homogènes et faire l'objet d'un suivi de l'évolution des résultats en application de l'article 9 du Reg CE 2073/2005. L'ensemble des informations recueillies sur les lots successifs d'un même produit permet d'avoir une estimation de la qualité microbiologique avec une précision qui s'accroît au cours du temps.
c) Cas particulier de Listeria monocytogenes⚓
Pour les aliments prêts à consommer ne permettant pas la croissance de Listeria monocytogenes de par leurs caractéristiques physico-chimiques (cf. Reg CE 2073/2005 : pH ≤ 4,4 ou aw ≤ 0,92 ou pH ≤ 5,0 et aw ≤ 0,94) ou leurs conditions de conservation (produits surgelés ou congelés ou produits réfrigérés à durée de conservation inférieure à 5 jours) ou d'autres paramètres (sous réserve d'une justification scientifique), le critère de 100 ufc/g s'applique pour les produits mis sur le marché pendant leur durée de conservation.
Ainsi, considérant l'absence de croissance de Listeria monocytogenes, la recherche et/ou le dénombrement de Listeria monocytogenes doivent être réalisés à J0 dans l'objectif d'évaluer le niveau de maîtrise du procédé de fabrication, tout en ayant la possibilité de mettre en œuvre des mesures de gestion en cas de résultat non-conforme.
Toutefois, pour les produits entrant dans la catégorie « ne permettant pas la croissance de Listeria monocytogenes » sur la base d'une justification scientifique, il peut être nécessaire de réaliser, en complément, des tests de vieillissement prenant en compte la variabilité inter-lots, et ce, afin de consolider le classement de la denrée dans cette catégorie sur la base également d'un historique de résultats de tests de vieillissement conformes.
Remarque : NB⚓
Pour cette catégorie d'aliments ne permettant pas la croissance de Listeria monocytogenes, le professionnel doit suivre avec pertinence les paramètres physico-chimiques permettant de s'assurer de la maîtrise du process (ex : aw, pH...) ou les autres mesures (exemple : concentration en conservateur) permettant de s'assurer de la maîtrise du process ou de la recette.
Il est à noter également que, malgré l'absence de croissance de Listeria monocytogenes, le professionnel doit mettre en œuvre toutes les mesures de maîtrise visant à prévenir ces contaminations.
Pour les aliments prêts à consommer permettant la croissance de Listeria monocytogenes, deux critères sont définis dans le Reg CE 2073/2005 :
« absence dans 25 g » en fin de production, critère appliqué dans le cas général, notamment lors de la première validation de la DVM d'un produit.
Dans ce cas, la recherche de Listeria monocytogenes doit être réalisée à J0 uniquement et ne sert pas à la détermination initiale de la DVM.
« ≤ 100 ufc/g pour les produits mis sur le marché pendant leur durée de conservation » et susceptibles de présenter un risque de contamination à la sortie de l'établissement de production.
Ce critère permet d'accepter la mise sur le marché de lots pour lesquels l'opérateur a défini un critère intermédiaire en fin de production en cas de présence de Listeria monocytogenes/25g.
Ce critère, à valider par l'opérateur, est en règle générale < 10 ufc/g ou à un seuil de détection inférieur à ce dernier avec une prévalence maîtrisée dans l'atelier de production), et ce, dès lors que le professionnel peut justifier que le seuil de 100 ufc/g sera respecté jusqu'à la fin de la DVM.
La validation de l'application d'un tel critère intermédiaire nécessite néanmoins la constitution d'un dossier, soumis à l'approbation des services d'inspection, comprenant :
- un historique de tests de vieillissement (ces tests seront d'autant plus pertinents qu'ils auront été réalisés sur des lots identifiés à J0 comme étant contaminés en Listeria monocytogenes). L'ensemble de ces résultats permettra de mieux évaluer le pourcentage d'unités susceptibles de dépasser le critère en fin de DVM, et, sous réserve de résultats favorables, d'augmenter le niveau de confiance dans l'évaluation de la maîtrise du process. Les résultats des tests de vieillissement obtenus simplement au stade de la validation initiale ne peuvent pas être jugés suffisants du fait de la faible prévalence de ce pathogène et doivent donc être complétés par des tests de vieillissement supplémentaires dans le cadre de la vérification ;
- et des études complémentaires (cf paragraphe V-B-5).
Dans l'attente de la constitution de ce dossier et de la démonstration du respect de la limite de 100 ufc/g pendant toute la durée de conservation, le critère applicable est « absence dans 25 g » en sortie de l'établissement.